“祸从口入”---食品添加剂苯甲酸可以酰化修饰组蛋白
景杰生物/报道
编者按
苯甲酸钠是常见的食品添加剂，在蜜饯、果干、汽水中广泛使用。此外苯甲酸钠也是FDA批准的药物，用于治疗尿素循环紊乱导致的高血氨症。虽然苯甲酸钠被认为是相当安全的食品添加剂，但是近期也有其对健康不利的报道。同时，日本现在已经对苯甲酸钠的使用作出限制，但是对于苯甲酸钠影响健康的分子机制还未知。
近日，芝加哥大学赵英明教授课题组在国际著名期刊Nature Communication上发表了题为“Lysine benzoylation is a histone mark regulated by SIRT2”的论文，报道了迄今唯一的发生在组蛋白赖氨酸上，含有苯环的酰化修饰----苯甲酰化修饰（图1），为蛋白质的翻译后修饰研究开辟新的领域，也为评价目前食品添加剂的安全性提供了新思路。赵英明教授课题组的黄河博士为文章的第一作者，参与本研究的还有香港大学的郝权教授、乔治亚大学Y. George Zhen教授。
图1. 苯甲酰化与乙酰化的比较
苯甲酸钠是被广泛使用的食品添加剂，FDA允许在食品中不高于0.1%的添加量，同时苯甲酸钠也被作为治疗高血氨症的药物。有报道指出，摄入苯甲酸钠可能会对人的健康产生伤害，用于治疗目的的苯甲酸钠若剂量不合适也会导致健康问题，但是对于苯甲酸钠影响人类健康的分子机制的研究并不明朗。
近日赵英明教授发现了发生在赖氨酸上的新型修饰-----苯甲酰化修饰，运用生物质谱与生物化学的方法鉴定出位于组蛋白的22个赖氨酸可发生苯甲酰化修饰，该种修饰会受到苯甲酸钠的激发，并受到SIRT2的调节。CHIP-Seq和RNA-Seq数据揭示出苯甲酰修饰主要集中在基因的启动子上，且其生理功能与乙酰化并非完全相同，会通过影响基因表达水平调控响应的通路。
1. 组蛋白上赖氨酸苯甲酰化修饰的鉴定和验证
作者提取了HepG2细胞的蛋白，进行胰蛋白酶酶解后，利用高效液相色谱-质谱联用，得到质谱数据（图2上）后，利用赵英明教授搭建的曾为无数翻译后修饰的发现立下汗马功劳的PTMap（Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jan 20;106(3):761-6.）分析数据，在H2B的第五位赖氨酸上发现了一个104.0268道尔顿的质量偏移，并通过人工合成肽段，比较HPLC的保留时间和质谱谱图，确定这个质量偏移是由一个苯甲酰基引起的。
（下）苯甲酰化泛抗体的质控
为了更好的研究苯甲酰化修饰，作者利用杭州景杰开发针对苯甲酰化修饰的泛抗体进行检测。检测结果显示，该抗体可以非常灵敏的检测到苯甲酰化修饰，而不会对赖氨酸上的其他种类的修饰产生非特异性结合（图2下）。
2. 苯甲酰化位点的鉴定
后续的研究中，通过检测5mM苯甲酸钠处理的细胞与对照组的差异，作者鉴定到了共计22个组蛋白的苯甲酰化修饰位点（图3）。令人振奋的是，几乎所有的苯甲酰化修饰位点都集中在组蛋白的N末端区域的赖氨酸侧链，这与广泛分布在组蛋白的赖氨酸的乙酰化、巴豆酰化产生了强烈对比，暗示了苯甲酰化在染色质的调控中可能扮演了与众不同的重要角色。
图3. 组蛋白上的苯甲酰化位点分布
3. 苯甲酸钠刺激条件下苯甲酰化修饰的动态调控
利用同位素氘标记的方法，作者确认了苯甲酸钠确实可以刺激细胞中苯甲酰化的发生，而同时细胞的乙酰化水平仅仅略有降低（图4）。作者同时指出，一些位点的苯甲酰化水平与乙酰化水平相当，显示出在暴露在富含苯甲酸钠的环境中，苯甲酰化的发生是非常普遍的。
图4. 苯甲酰化水平受到苯甲酸钠浓度低影响
4. SITR2可以在体内体外去除苯甲酰化修饰
HDAC，组蛋白去乙酰化酶是一类可以将乙酰基团从组蛋白上移除的一类酶。其中一种HDAC，SIRT2被鉴定出具有明显的去苯甲酰化酶活性（图5左上），并且催化过程依赖于NAD+，且可以被第三类HDAC抑制剂（例如NAM）抑制其催化活性，而不受TSA的影响（图5右上）。作者还进一步比较了SIRT2的去乙酰化和去苯甲酰化酶活性的区别（图5下）。
图5. SIRT2依赖于NAD+的去苯甲酰化修饰酶活性
5. 苯甲酰化修饰的全基因组分布
为了研究组蛋白苯甲酰化修饰在全基因组的分布情况，作者在苯甲酸钠处理后的细胞中利用CHIP-Seq的方法鉴定到了20283个发生苯甲酰化修饰的位点，其中超过半（57.33%）的苯甲酰化修饰发生在基因的启动子中（图6 左上）。类似于赖氨酸的乙酰化，苯甲酰化修饰较少发生在TSS区域，而较多地发生在TSS的上下游（图6 上中），预示着苯甲酰化在转录调控中扮演的重要作用，而作者对CHIP-Seq数据与基因表达水平的相关性分析支持了这一猜想（图6 右上）。
图6. 苯甲酰化在基因组的分布特点及验证
后续的生物信息学分析发现，苯甲酰化修饰相对于乙酰化修饰，主要调节甘油磷脂的代谢，卵巢甾类的合成，水解磷脂酶D的信号通路，血清素突触以及胰岛素的分泌过程。而RT-qPCR也验证了这些结论（图6 下）。
作为赖氨酸上的新型酰化修饰，苯甲酰化修饰显得与众不同，它是已知的发生在赖氨酸上的唯一含有苯环的修饰，其修饰基团较大（是乙酰化的2倍）且有较强的疏水性（是乙酰化的3倍）。
组蛋白通过乙酰化调节与DNA的相互作用进而调控基因的表达水平，而拥有更加显著结构影响力的苯甲酰化修饰可以预见对基因的调控作用会更加明显，作者猜测有蛋白质能够特异性识别苯甲酰化修饰并影响基因的表达及染色质的构型。
此外，苯甲酰化修饰可能广泛分布在蛋白质组中，在非组蛋白的功能调控中也发挥着潜在的重要作用。作为食品添加剂和药品的苯甲酸钠，会在摄入后引起转录反应，该研究为苯甲酸钠的毒性功能提出了分子机制探究上的线索。
发现新的蛋白质翻译后修饰，作为一线科研工作者的我们应该怎么赶上这班车？景杰生物作为世界上唯一一家拥有泛苯甲酰化修饰抗体并可开展苯甲酰修饰组学的公司，可以助力大家进行以下方向的研究：
1. 鉴定苯甲酰连接酶和苯甲酰化酶
2. 利用泛苯甲酰修饰抗体，结合LC-MS/MS技术，研究苯甲酰修饰组学
3. 研究非组蛋白苯甲酰修饰的功能
4. 研究组蛋白苯甲酰修饰的位点特异性功能
5. 研究苯甲酰修饰的组织及位点特异性
6. 研究苯甲酸钠及其类似衍生物对苯甲酰修饰水平的影响，以及产生的后果
7. 从苯甲酰化修饰的角度研究肠道微生物与宿主的相互作用
参考文献
He Huang, et al., 2018, Lysine benzoylation is a histone mark regulated by SIRT2, Nature Communication.
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